荧光定量RT-PCR

     特点

     染料法结合探针法，增强检测灵敏性及可靠性

     功能强大的ABI StepOne^TM 实时荧光定量PCR仪

     原理

      实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR 能够专一，灵敏，快速，高重复地精确定量起始模板的浓度。该技术已经广泛应用于检测细胞mRNA表达差异，检测，验证芯片结果，验证 shRNA干扰效果，病毒、病原菌等致病微生物拷贝数定量及各种生物制品食品安全鉴定。作为一种新型的PCR技术，RT-PCR技术将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，与通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时观测PCR反应进行的情况，解决了传统PCR难以对扩增起始模板的量进行测定的难题，并具有快速、避免交叉污染等特点。

      服务内容

      绝对定量

      绝对定量首先必须构建与检测样品目的基因具有相同序列的标准品。使用已知浓度的标准品制作5个点以上的标准曲线后，可以使用标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量 (起始拷贝数)分析。

       相对定量

       基因表达的研究一般采用相对定量的方法，而改进的相对定量方法-双标准曲线法，是一种更准确的定量方法。双标准曲线法就是每次实验都分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线，并同时扩增各个样本中目的基因和内参基因，然后从各自标准曲线上计算待测样本中初始表达量，将目的基因表达量进行归一化处理以消除初始模板量的差异带来的表达差异，即可得出不同样本目的基因的表达量差异。内参基因通常选用表达量相对恒定的Housekeeping Gene，如：GAPDH、β-actin等。

      客户提供

      进行mRNA表达量分析时，请寄送足量的并且保证纯度的Total RNA (浓度在500 ng/μl以上，体积在 20 μl以上)。如果目的基因表达量低时，应尽量提供更高浓度的Total RNA。如果提供的材料为细胞或组织，应保证材料新鲜，动物细胞数为10⁶以上，动物组织为100 mg以上。

      我们提供

      实验报告，包括具体实验步骤、mRNA电泳图、标准曲线、扩增曲线、熔解曲线、CT值 Excel表格

      质量保证

      严格进行PCR优化，利用熔解曲线分析保证产物的特异性

     针对每个样品目的基因的荧光定量PCR均进行三孔平等实验，保证实验结果的准确性

     如因实验材料等非本公司原因造成某实验步骤失败而使实验提前终止，已启动的实验项目仍正常收费。