小鼠抗体ScFv基因扩增试剂盒
（货号：P001Z）
一、包装清单
|
管号
|
名称
|
内容
|
规格
|
|
1#
|
MVH Mix
|
小鼠抗体重链扩增体系
|
100μL
|
|
2#
|
MVL Mix
|
小鼠抗体轻链扩增体系
|
100μL
|
|
3#
|
DNA Polymerase
|
DNA聚合酶
|
2 μL
|
|
4#
|
Positive control
|
阳性对照
|
2μL
|
|
5#
|
ScFv Mix
|
ScFv连接扩增体系
|
100μL
|
|
6#
|
ScFv Enhancer Mix
|
ScFv增强体系
|
100μL
|
二、产品简介
本试剂盒可以用于对杂交瘤、小鼠外周血单个核细胞、小鼠脾细胞及小鼠其他组织中抗体可变区基因的扩增和调取。相关标本前期需经过mRNA提取和用oligo
dT为引物反转录成cDNA。本试剂盒优化了扩增体系中的组分，既保证了扩增的特异性，又扩大了对所有抗体基因的兼容性。一步PCR分别扩增VH和VL，再一步PCR将二者连接成ScFv。连接成的ScFv适合直接克隆到原核或者真核表达载体中进行表达，或小鼠抗体文库的构建、基因工程抗体改造、CAR(Chimeric Antigen Receptor T-Cell) 载体构建等。
三、产品特点
简单快速：一步扩增抗体基因，一步连接成ScFv；
特异性好：仅抗体可变区得到扩增，无无关基因干扰；
兼容性强：可扩增绝大部分抗体基因，保持了抗体的多样性；ScFv适用于原核或真核表达系统；
四、注意事项
1、试剂避免反复冻融，否则会影响扩增效率；
2、建议采用新鲜标本的cDNA 为模板
3、所有试剂保存条件为-20℃
4、仅供科研使用
五、操作步骤
1、所有试剂融化后瞬时离心并放置于冰上
2、扩增抗体重链和轻链基因
2.1 按下列组分配制反应体系（以50μL为例）
|
名称
|
体积(μL)
|
|
MVH Mix(Vial 1#) /MVL Mix(Vial 2#)
|
45
|
|
DNA Polymerase
|
0.3
|
|
cDNA
|
a(含10-500ng DNA,约0.2-1μL)
|
|
H2O
|
4.7-a
|
如需做阳性对照，将cDNA换成0.5μL Positive control（Vial 4#）即可。
按下列条件扩增
|
Temp
|
Time
|
Cycles
|
|
94℃
|
3min
|
1
|
|
94℃
|
30s
|
30
|
|
52-56℃
|
30s
|
|
72℃
|
45s
|
|
72℃
|
10min
|
1
|
|
4℃
|
∞
|
1
|
2.2 PCR产物过2%琼脂后，回收330bp左右的条带
3. 连接ScFv
3.1按下列组分配制反应体系（以50μL为例）
|
名称
|
体积(μL)
|
|
ScFv Mix (Vial 5#)
|
45
|
|
DNA Polymerase
|
0.3
|
|
VH
|
a(含10-20ng DNA)
|
|
VL
|
b(含10-20ng DNA)
|
|
H2O
|
4.7-a-b
|
按下列条件扩增
|
Temp
|
Time
|
Cycles
|
|
94℃
|
3min
|
1
|
|
94℃
|
30s
|
30
|
|
52-56℃
|
30s
|
|
72℃
|
45s
|
|
72℃
|
10min
|
1
|
|
4℃
|
∞
|
1
|
3.2 PCR产物过2%琼脂后，回收700bp左右的条带，进行TA克隆后即可得到ScFv片段。
4. 可选择步骤（当上述步骤扩增的ScFv条带出现杂带、弥散或者700bp左右的条带较弱，需要增加ScFv产量时可进行此步骤）
4.1 回收步骤3中700bp的条带作为模板
4.2按下列组分配制反应体系（以50μL为例）
|
名称
|
体积(μL)
|
|
ScFv Enhancer Mix (Vial 6#)
|
45
|
|
DNA Polymerase
|
0.3
|
|
ScFv(步骤3回收)
|
a(含10-20ng DNA)
|
|
H2O
|
4.7-a
|
按下列条件扩增
|
Temp
|
Time
|
Cycles
|
|
94℃
|
3min
|
1
|
|
94℃
|
30s
|
30
|
|
56℃
|
30s
|
|
72℃
|
45s
|
|
72℃
|
10min
|
1
|
|
4℃
|
∞
|
1
|
4.3 PCR产物过2%琼脂后，回收700bp左右的条带，进行TA克隆后即可得到ScFv片段。
|
cDNA克隆
Lv-up慢病毒浓缩试剂
