小鼠抗体scFv基因扩增试剂盒-CAR-T研究-产品中心-PPL质粒与蛋白共享库
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    小鼠抗体scFv基因扩增试剂盒
    基本信息
      Catalog number: P001Z
      Description:

    小鼠抗体ScFv基因扩增试剂盒

    (货号:P001Z

    一、包装清单

    管号

    名称

    内容

    规格

    1#

    MVH Mix

    小鼠抗体重链扩增体系

    100μL

    2#

    MVL Mix

    小鼠抗体轻链扩增体系

    100μL

    3#

    DNA Polymerase

    DNA聚合酶

    2 μL

    4#

    Positive control

    阳性对照

    2μL

    5#

    ScFv Mix

    ScFv连接扩增体系

    100μL

    6#

    ScFv Enhancer Mix

    ScFv增强体系

    100μL

     

    二、产品简介

    本试剂盒可以用于对杂交瘤、小鼠外周血单个核细胞、小鼠脾细胞及小鼠其他组织中抗体可变区基因的扩增和调取。相关标本前期需经过mRNA提取和用oligo dT为引物反转录成cDNA。本试剂盒优化了扩增体系中的组分,既保证了扩增的特异性,又扩大了对所有抗体基因的兼容性。一步PCR分别扩增VH和VL,再一步PCR将二者连接成ScFv。连接成的ScFv适合直接克隆到原核或者真核表达载体中进行表达,或小鼠抗体文库的构建、基因工程抗体改造、CAR(Chimeric Antigen Receptor T-Cell) 载体构建等。

     

    三、产品特点

    简单快速:一步扩增抗体基因,一步连接成ScFv;

    特异性好:仅抗体可变区得到扩增,无无关基因干扰;

    兼容性强:可扩增绝大部分抗体基因,保持了抗体的多样性;ScFv适用于原核或真核表达系统;

     

    四、注意事项

    1、试剂避免反复冻融,否则会影响扩增效率;

    2、建议采用新鲜标本的cDNA 为模板

    3、所有试剂保存条件为-20℃

    4、仅供科研使用

     

    五、操作步骤

       1、所有试剂融化后瞬时离心并放置于冰上

       2、扩增抗体重链和轻链基因

    2.1 按下列组分配制反应体系(以50μL为例)

    名称

    体积(μL)

    MVH Mix(Vial 1#) /MVL Mix(Vial 2#)

    45

    DNA Polymerase

    0.3

    cDNA

    a(10-500ng DNA,0.2-1μL)

    H2O

    4.7-a

    如需做阳性对照,将cDNA换成0.5μL Positive control(Vial 4#)即可。

    按下列条件扩增

    Temp

    Time

    Cycles

    94

    3min

    1

    94

    30s

    30

    52-56

    30s

    72

    45s

    72

    10min

    1

    4

    1

    2.2 PCR产物过2%琼脂后,回收330bp左右的条带

    3. 连接ScFv

       3.1按下列组分配制反应体系(以50μL为例)

    名称

    体积(μL)

    ScFv Mix (Vial 5#)

    45

    DNA Polymerase

    0.3

    VH

    a(10-20ng DNA)

    VL

    b(10-20ng DNA)

    H2O

    4.7-a-b

    按下列条件扩增

    Temp

    Time

    Cycles

    94

    3min

    1

    94

    30s

    30

    52-56

    30s

    72

    45s

    72

    10min

    1

    4

    1

    3.2 PCR产物过2%琼脂后,回收700bp左右的条带,进行TA克隆后即可得到ScFv片段。

    4. 可选择步骤(当上述步骤扩增的ScFv条带出现杂带、弥散或者700bp左右的条带较弱,需要增加ScFv产量时可进行此步骤)

        4.1 回收步骤3中700bp的条带作为模板

       4.2按下列组分配制反应体系(以50μL为例)

    名称

    体积(μL)

    ScFv Enhancer Mix (Vial 6#)

    45

    DNA Polymerase

    0.3

    ScFv(步骤3回收)

    a(10-20ng DNA)

    H2O

    4.7-a

    按下列条件扩增

    Temp

    Time

    Cycles

    94

    3min

    1

    94

    30s

    30

    56

    30s

    72

    45s

    72

    10min

    1

    4

    1

    4.3 PCR产物过2%琼脂后,回收700bp左右的条带,进行TA克隆后即可得到ScFv片段。

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